Mecanismos de Variación Antigénica en Anaplasma marginale / Mechanisms of Antigenic Variation in Anaplasma marginale

Anaplasma marginale (A. marginale), es una bacteria del orden de las Rickettsias que ocasiona la anaplasmosis bovina en regiones tropicales y subtropicales del mundo. Esta enfermedad, trasmitida principalmente por tábanos y garrapatas, se desarrolla típicamente en una etapa inicial aguda con manifestaciones clínicas caracterizadas principalmente por anemia y fiebre. Después de un par de meses, los animales recuperan su condición física y se hacen asintomáticos, siendo incapaces de eliminar completamente la bacteria, convirtiéndose en animales persistentemente infectados. Esto se debe a la capacidad de A. marginale para evadir el sistema inmune. En este sentido, se ha demostrado la existencia de un mecanismo de variación antigénica en las proteínas MSP1, MSP2 y MSP3 de la bacteria. Al evaluar la familia multigénica que codifica para la MSP2, se determinó que está conformada por dos regiones conservadas que flanquean una región central hipervariable. De esta manera, al expresarse cada una de las 52 variables de la MSP2, se expresa un epítope diferente. Cuando se describió el genoma completo de este hemotrópico, se encontró también la presencia de 16 pseudogenes msp2, los cuales pueden ser recombinados dentro del sitio de expresión del operón de la MSP2, constituyendo un segundo mecanismo de variación. Además de ello, los fragmentos hipervaribles y los pseudogenes se pueden combinar entre sí, en un proceso denominado conversión génica, creando nuevos epítopes “recombinantes”, confiriendo una capacidad de variabilidad antigénica casi infinita al A. marginale (tercer mecanismo). Un cuarto mecanismo de variación antigénica, lo constituye la dimerización de la MSP2 sobre la superficie del A. marginale, debido a que la expresión simultánea de variantes conforman epítopes únicos. En conclusión, la recombinación génica de la MSP2 y su dimerización en la membrana, constituye un mecanismo muy eficiente de variación antigénica para eludir el sistema inmunológico del hospedador.

Anaplasma marginale (A. marginale) is a bacterium of the Rickettsiales order that causes bovine anaplasmosis in tropical and subtropical regions worldwide. This disease, mainly transmitted by ticks and horseflies, typically develops in an initial acute stage, with clinical signs characterized by anemia and fever. After two months, animals recover their original physical condition and become asymptomatic, being unable to completely eliminate the bacterium, turning into persistently infected animals. This is due to the ability of A.marginale to evade the immune system. In this regard, the existence of a mechanism for antigenic variation in proteins of the bacterium, such as MSP1, MSP2, and MSP3, has been demonstrated. When assessing the multigenic family which encodes for MSP2, it was determined that it consists of two conserved regions flanking a central hypervariable region. Thus, when expressing each of the 52 MSP2 variables, a different epitope is also expressed. When the entire genome of this parasite was decoded, the presence of 16 pseudogenes for MSP2 was also discovered. These pseudogenes can be recombined within the operon expression site of MSP2, providing a second mechanism of variation. Moreover, both the hypervariable fragments and pseudogenes can combine among them, in a process called gene conversion, creating new “recombinant” epitopes, conferring the A. marginale with an almost infinite capacity for antigenic variability (third mechanism). A fourth mechanism of antigentic variation consists of the dimerization of MSP2 on the surface of A. marginale, because the simultaneous expression of variants creates unique epitopes. In conclusion, gene recombination of MSP2 along with the dimerization of MSP2 on the membrane provides a very efficient mechanism for antigenic variation for evading the host’s immune system.

Morfometría Comparativa de Cinco Aislados Venezolanos Trypanosoma vivax / Comparative Morfometric of five Venezuelan Trypanosoma vivax isolates

La tripanosomosis causada por Trypanosoma vivax, se encuentra distribuida en las regiones tropicales y subtropicales de África, América Latina y Asia, causando grandes pérdidas económicas. Los análisis biométricos previos reportan que T. vivax mide entre 18 y 31 µm; sin embargo, pocos estudios de este tipo se han realizado en Venezuela. El objetivo del presente estudio fue describir y comparar la morfometría de cinco aislados de T. vivax, con el propósito de demostrar la variabilidad en el tamaño de los protozoarios obtenidos a partir de bovinos con infecciones activas en diferentes zonas geográficas del país. Para ello, se realizaron infecciones experimentales en ovinos y se tomaron muestras de sangre en el primer pico de parasitemia. Se registraron microfotografías de los estadios hematozoicos (20 micrografías de microscopia electrónica de barrido) de cada aislado para estudios morfológicos. Los resultados revelaron diferencias significativas (p<0,05); (p<0,01) en la longitud entre los aislados. Los valores totales promedios fueron: 20,99 ± 2,10 µm, con variaciones medias entre 18,12 ± 4,42 µm en los de menor tamaño y 24,35 ± 5,55 µm en la mayor longitud, respectivamente. Por lo tanto, se demostró la existencia de variabilidad en el tamaño de estos hemoparásitos de Venezuela.

Trypanosomosis caused by Trypanosoma vivax (T. vivax), is distributed in tropical and subtropical regions of Africa, Latin America and Asia, causing great economic losses. Previous biometric analysis report that T. vivax measures between 18 and 31 µm; but few such studies have been conducted in Venezuela. The aim of this study was to describe and compare the morphometry of five isolates of T. vivax, to demonstrate the variability in size of the protozoa obtained from naturally-infected cattle in different geographical areas of Venezuela. To accomplish this, experimental infections were induced in sheep and blood samples were taken at the first peak of parasitemia. Micrographs of stages of hematozoa (20 micrographs of each specimen using scanning electron microscopy) were recorded for morphological studies. The results of this research revealed significant (p<0.05); (p<0.01) statistical differences in length among them. The total average length was 20.99 ± 2.10 µm, with variations which ranged from 18.12 ± 4.42 µm, for smaller lengths, and 24.35 ± 5.55 µm, for greater lengths, respectively. Therefore, the existence of variability in the size of these hemoparasites in Venezuela was demonstrated.

Prevalencia de trypanosoma spp. mediante ELISA e inmunofluorescencia indirecta en tres rebaños de búfalos de agua del estado Cojedes, Venezuela / Prevalence of trypanosoma spp. by ELISA and indirect fluorescent antibody test in three water buffaloes herds from the State of Cojedes, Venezuela

Animal trypanosomiasis is a disease caused by parasites of the genus Trypanosome. This malady is widely distributed in many countries, located in tropical and subtropical areas of the world where blood-sucking flies are present. Water buffaloes are important domestic animals used for meat and milk production, and draught power. Buffalo herds are raised in areas where trypanosomiasis is endemic. In Venezuela, the buffalo industry is becoming a very important and common livestock. However, animals imported from non-endemic areas may suffer severe infections. The development of methods which ensure an efficient epidemiological surveillance against this disease is of great relevance. The immunological tests are of great importance for this purpose, because of the low sensitivity of the current parasitological methods, due to the low parasite burden that occur in subclinical and chronic infections caused by trypanosomes. To estimate the serological prevalence of trypanosome in water buffaloes, an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used in buffalo samples of healthy animals from the municipalities of Rómulo Gallegos, Ricaurte and Girardot, in the State of Cojedes, Venezuela. Additionally, samples were also assessed with the indirect fluorescence antibody test (IFAT) and the microhematocrit test (MHCT). A total of 180 blood samples, none of which had an active parasitemia by TMC, were assessed. The prevalence determined by ELISA was 45.56%, which was significantly (P<0.05) higher than that obtained by IFAT (28.89%). The results of the experiments showed a moderate Kappa index of concordance of 0.45 (95% CI: 0.31-0.58); whereas the concordance value for both tests was 73.33%. Both the sensitivity and specificity of ELISA, compared to the IFAT, was 82.69% and 69.53%, respectively. The predictive positive and negative values were 52.44% and 90.82%, respectively. The findings suggest an endemic condition, with moderate infection values caused by Trypanosoma spp. in buffaloes from these regions of Venezuela and show, for the first time, the usefulness of ELISA for epidemiological studies of trypanosomiasis.

Serological evidence of Anaplasma spp. in small ruminants from Venezuela using recombinant MSP5 in immunoenzymatic assay / Evidencia serológica de Anaplasma spp. en pequeños rumiantes de Venezuela utilizando MSP5 recombinante en ensayos inmunoenzimáticos

Anaplasma marginale causes a disease in cattle characterized by fever, anemia and decrease in milk and meat production. Small ruminants do not show signs of disease when infected, but it has been suggested they could act as reservoirs. Goat and sheep breeding is socially and economically important in arid and semi-arid areas in Venezuela, and these species often share space and food with cattle. The aim of this work was to detect antibodies against Anaplasma spp. in Venezuelan goat and sheep flocks. To accomplish this goal, an indirect ELISA using recombinant MSP5 as antigen of A. marginale was performed. Sera obtained from experimental infection in goat and a hyperimmune sheep serum were used as positive controls. Blood sera were obtained from 45 sheep and 48 goats located in Guárico State, an endemic area to bovine anaplasmosis. After standardization of assay for each species, 80.46% of the sheep and 59.25% of the goat sera showed to have antibodies against MSP5. No signs of clinical disease were detected in sampled animals. These results suggest that small ruminants could harbour A. marginale and consequently may be reservoirs for neighbouring cattle if appropriate vectors are present. The development of clinical diseases caused by A. marginale under stress situations and the existence of other Anaplasma species (e.g. A. ovis) in small ruminants should also be investigated.

Anaplasma marginale ocasiona una enfermedad en los bovinos caracterizada por fiebre, anemia y disminución de la producción de leche y carne. Los pequeños rumiantes generalmente no muestran signos clínicos, por lo que pudieran actuar como reservorio. En Venezuela, los ovinos y caprinos tienen gran importancia económica y socialmente en zonas áridas y semi- áridas e incluso, en muchas ocasiones comparten su espacio y alimento con los bovinos. El objetivo de este trabajo fue detectar anticuerpos contra Anaplasma spp. en rebaños de ovinos y caprinos. Para ello, se estandarizó un ELISA indirecto con la MSP5 recombinante de A. marginale, empleando sueros provenientes de infecciones experimentales en caprinos y un suero hiperinmune ovino como controles positivos. Posteriormente, fueron obtenidos sueros sanguíneos de 45 ovinos y 48 caprinos localizados en una zona endémica a anaplasmosis bovina del estado Guárico. De estos, 80,46% de los ovinos y 59,25% de los caprinos presentaron anticuerpos que reconocieron la MSP5, sin embargo, ninguno de estos animales positivos presentaron signos clínicos de la enfermedad. Estos resultados sugieren que los pequeños rumiantes son portadores de A. marginale y por ende, pueden estar actuando como reservorio de la enfermedad para los bovinos en el caso que se encuentren los vectores apropiados. Por lo tanto, se debe profundizar en los estudios sobre el desarrollo de sintomatología clínica en condiciones de estrés y la existencia de otras especies de Anaplasma (como A. ovis) en los ovinos y caprinos de Venezuela.

Tiempo de supervivencia in vivo y criopreservación de Trypanosoma vivax / In vivo survival time and cryopreservation of Trypanosoma vivax

Uno de los problemas más comunes del trabajo con Trypanosoma vivax, es la supervivencia y criopreservación de este protozoario, lo cual origina pérdida de aislados de campo y errores en exámenes parasitológicos. Se propone evaluar la supervivencia in vivo en condiciones de campo y criopreservación de T. vivax. Para determinar la supervivencia, la sangre se sometió a temperatura ambiente y refrigeración a 4°C, luego se determinó la sobrevivencia en el tiempo. Para el estudio de criopreservación, se emplearon dos crioprotectores de diferente naturaleza química: glicerol 10 por ciento y DMSO 5 por ciento de concentración final. Además, la criopreservación se realizó bajo tres condiciones de almacenamiento en nitrógeno líquido: 1) fase gaseosa 2) líquida y 3) combinación de ambas. Durante la evaluación de la supervivencia, se observó que la sobrevivencia de T. vivax en sangre refrigerada disminuyó significativamente (P<0,01), en comparación con aquellas sometidas a temperatura ambiente. Sin embargo, la sobrevivencia de éstos últimos comienza a disminuir luego de 6 horas, aunque algunos hemoparásitos permanecieron viables hasta 24 horas post-recolección. Para evaluar la criopreservación, al cabo de dos semanas, se descongelaron los crioviales, se determinó la sobrevivencia, resultando negativas las muestras sometidas a congelamiento directo en fase líquida. Los otros dos métodos empleados, resultaron similares (estadísticamente no significativos), el glicerol 10 por ciento resultó con mayor número de parásitos viables. En conclusión, se determinó que, las muestras infectadas con T. vivax deben evaluarse antes de 8 horas post-recolección y mantenerlas a temperatura ambiente. Por otra parte, el congelamiento debe realizarse en primera instancia en fase gaseosa o combinación gaseosa/líquida, empleando glicerol 10 por ciento. Estos resultados, permiten sugerir la mejor metodología a ser empleada para la supervivencia de los parásitos antes de exámenes parasitológicos...

One of the common problems working with Trypanosoma vivax is its survival and cryopreservation, which originates loss of field isolates and parasitological examinations mistakes. The aim of this paper was to study the best methodologies for in vivo survival under field conditions and cryopreservation of the T. vivax. In order to study complete blood survival of T. vivax, two surviving conditions were tested at: room temperature and refrigeration at 4°C. The result shows that surviving in cooled sampled diminished significantly (P<0.01) compare with room temperature. Nevertheless, surviving of room temperature parasite begins to diminish after 6 hours, although some parasites remained viable up to 24 hours post-harvesting. Cryopreservation studies were made under three liquid nitrogen storage conditions: 1) gaseous phase 2) liquid and 3) gaseous/ liquid phase combination (glycerol 10 percent and DMSO 5 percent, were used as cryoprotectants). After two weeks and defrost the survive of T. vivax from cryovials determined. The result show that: a) direct freezing in liquid phase samples were negative and b) the other two methodology were positive and statistically similar, glycerol 10 percent resulted with the greatest number of viable parasites. In conclusion, these results suggest that the best methodologies for conservation under field conditions, were that the samples infected with T. vivax must be evaluated before 8 hours post-harvesting at room temperature and cryopreservation condition of the T. vivax, must be made in gaseous phase or gaseous/liquid phase combination.

Evaluación y mejoramiento del ensayo inmunoenzimático (ELISA) para el diagnóstico de la anaplasmosis bovina, utilizando las MSP5 recombinante como antígeno / Evaluation and improvement of an immunoenzimatic assay (ELISA) for diagnosis of bovine anaplasmosis, using recombinant MSP5 as antigen

La anaplasmosis, es una enfermedad producida por la bacteria Anaplasma marginale que está ampliamente distribuida en Venezuela, originando efectos negativos en la salud y productividad de los rebaños bovinos. Hasta el presente se han caracterizado 6 proteínas mayoritarias de superficie (MSP) de esta bacteria, de las cuales la MSP5, ha sido señalada como un excelente polipéptido para el diagnóstico de la enfermedad, debido a que esta proteína es altamente conservada e inmunogénica. Esto ha motivado su clonamiento e inserción en un plásmido de E. coli, para usarla purificada como antígeno en ensayos inmunoenzimáticos. Sin embargo, estudios posteriores, indican que proteínas de E. coli recombinante que eluyen conjuntamente con la MSP5 durante el proceso de purificación, interfieren en el ELISA originando falsos positivos. En el presente trabajo se estandarizó un ELISA indirecto, utilizando la MSP5 como antígeno y se logró disminuir las uniones inespecíficas a las proteínas contaminantes de E. coli, por adición de un suero de conejo anti E. coli que bloquea los epítopes de estas proteínas. A través de un cuadro de contingencia de doble entrada, se determinaron los parámetros de validación del ELISA al compararla con la técnica de naranja de acridina-bromuro de etídio, obteniéndose como resultado que la técnica de ELISA mejorada es 96,1 por ciento sensible, 9 por ciento específica y presenta un valor predictivo del 88,6 por ciento. Además, se estudió una población bovina de 48 mautes de la Estación Experimental La Iguana (estado Guárico), utilizando ambas técnicas, obteniendo una seroprevalencia de 93,7 por ciento por ELISA y una prevalencia de 54,1 por ciento por naranja de acridina-bromuro de etidio. Estos resultados muestran que el bloqueo de los epítopes de las proteínas de E. coli contaminates, utilizando para ello un suero de conejo anti-E. coli, permite disminuir los falsos negativos cuando se utilizan proteínas recombinantes.

Anaplasmosis, is a disease produced by Anaplasma marginale widely distributed in Venezuela, causing negative effects on the health and productivity of bovine herds. Until now, 6 constitutive Anaplasma marginale Mayor Surface Proteins (MSPs) have been characterized, including MSP5 which appears to be an excellent polypeptide for the diagnosis of this disease since it is highly conserved and immunogenic. This has motivated its cloning and insertion into a plasmid in E. coli and the use of the purified antigen in immunoenzymatic assays. However, subsequent indicated that E. coli recombinant proteins, that copurify with MSP5, interfere with the ELISA giving rise to false positives. In the present study, it was accomplished the standardization of an indirect ELISA, using MSP5 as the antigen and it was also diminishing the non-specific unions to the contaminating proteins of E. coli by adding anti-E. coli rabbit serum that blocks the epitopes of these proteins. With the use of a double entry contingency table, the parameters of validation of the ELISA were determined, comparing it to the acridine orange-ethidium bromide technique. The result indicate that the improve MSP5 indirect ELISA has a 96.1% sensitivity, 9% specificity and a predictive value of 88.6%. It was also studied a bovine population of 48 cattle from the Experimental Station “La Iguana” (Guárico State), using both techniques, obtaining a seroprevalence of 93.7% with ELISA and a prevalence of 54.1% with orange acridine-ethidium bromide. These results show that the blockage of the contaminating E. coli protein epitopes using an anti-E. coli rabbit serum permits the diminishment of false negatives when using recombinant proteins.

Uso de proteínas como alternativa diagnóstica para discriminar infecciones entre Trypanosoma vivax y Trypanosoma evansi / Use of proteins as diagnostic tool to discriminate between Trypanosoma vivax and Trypanosoma evansi infections

Tripomastigotes sanguícolas de Trypanosoma vivax y Trypanosoma evansi obtenidos de infecciones experimentales en ovejas y ratones respectivamente, fueron utilizados para purificar y caracterizar proteínas citosólicas mediante el método de partición con Tritón X-114. Los resultados revelan diferencias en los patrones proteicos entre las dos especies. Asimismo, las reacciones antigénicas mediante Western blot utilizando suero de animales naturalmente infectados, permitió discriminar las infecciones entre ambos parásitos. Se sugiere la utilización de esta metodología como una prueba diagnóstica confiable.